第一章医学微生物学实验技术

第一节细菌的形态学实验技术

细菌的形态学特征（如大小、形状、排列、运动、荚膜、芽孢、鞭毛等）以及细菌的染色性对于某些细菌鉴别有诊断意义。这些细菌包括化脓性球菌、厌氧芽孢杆菌、分支杆菌、棒状杆菌、霍乱弧菌、螺旋体等，详见表2-5-1。对于形态染色缺乏明显特点的细菌，则不能单凭形态学特征和染色性来鉴定细菌的种属。

细菌的形态结构在适宜条件下是较为恒定的，但当环境条件发生改变时，形态结构可发生一定程度的改变，如细胞壁缺陷型细菌即L型细菌。细菌的染色性与菌龄等具体情况有关，如处于衰退期的革兰染色阳性（G⁺）细菌易变为革兰染色阴性（G^-）、G⁺细菌在吞噬细胞内易变为G^-。在进行细菌形态学检查时，应注意到这些变化。

表2-5-1镜检诊断的细菌感染

病种	检样	方法	结果
鼠疫	痰、腺穿刺液	革兰染色、亚甲蓝染色	G-两极浓染杆菌
霍乱	水样便	革兰染色、制动试验	G-弧菌、运动活泼
炭疽	痰、病变渗出液	革兰染色、串珠试验	G+荚膜大杆菌、串珠+
白喉	假膜、局部棉拭子	革兰染色、亚甲蓝染色	G+棒状杆菌有异染颗粒
淋病	尿道分泌物	革兰染色、亚甲蓝染色	细胞内G-双球菌
脑膜炎	瘀斑血、组织液、脑脊液	革兰染色、亚甲蓝染色	G-细胞内、外双球菌
肺结核	痰	抗酸染色	红色杆菌、背景蓝色
麻风	切开表皮，刀刮组织液	抗酸染色	红色杆菌、背景蓝色
肺炎	铁锈样痰	革兰染色，荚膜显示	G+矛头状双球菌有荚膜
化脓症	脓汁	革兰染色	G+葡萄状或链球状
梅毒	病变渗出液压片	暗视野	白色折光运动密螺旋体
钩体病	第1周采血，第2周采尿	暗视野	亮点相连，有活动
回归热	发热期采血制厚片	暗视野，姬姆萨染色	如毛发卷曲，

形态学检查方法可分为不染色法和染色法两大类。

一、不染色法

细菌标本不经染色，用压滴法、悬滴法或毛细吸管法在普通光学显微镜下观察。只能看到细菌大致的外表轮廓和有无动力。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以辨别。

(一)压滴法

接种环通过火焰灭菌后取待检菌液2环～3环，放于载玻片中央。或用无菌毛细吸管于载玻片中央点样。用镊子夹住盖玻片，覆盖于菌液上。放置时，先使盖玻片一边接触菌液。以无气泡、检样不溢出盖玻片为佳,立即镜检。

有鞭毛的细菌，具有真正的运动，能定向地由一个地方快速地泳动到另一个地方。无鞭毛的细菌由于体积微小，受到所处环境中液体分子的冲击而仅呈左右前后位置变更不大的摇摆颤动，又称布朗运动。

(二)悬滴法

按压滴法将待检菌液加在盖玻片中央成小液滴。将准备好的凹玻片四周涂少许凡士林。将凹玻片的凹窝对准小液滴放在盖玻片上，轻按粘着在盖玻片上后翻转，液滴下垂，故名。此法较压滴法操作麻烦，但液滴处于封闭的小室中，可防止液滴的干燥和气流的影响。

(三)毛细管法

将孔径0.5mm～1.0mm,长60mm～70mm的无菌毛细吸管插入待检菌液中，由毛细作用吸入菌液，然后两端沾热熔的封蜡封死，用透明胶带将毛细管固定在载玻片上镜检，此法适用于观察厌氧菌的动力。

二、染色法（见第三章染色技术）

第二节细菌生理学实验技术

细菌是单细胞微生物，能从外界环境中摄取营养物质，进行新陈代谢。细菌代谢重要特点之一就是代谢十分活跃和代谢类型的多样性。了解细菌的代谢，从而促进有益菌生长，消灭致病菌，对于工农业生产及医疗实践具有重要的意义。生化反应是细菌代谢类型多样性的集中体现，可作为细菌分类和鉴定的依据，尤其对于形态、染色反应和培养特性相同或相似的细菌更为重要。生化反应主要是根据不同细菌对营养物质分解的产物不同，来鉴定细菌。

一、细菌的培养

除麻风杆菌、梅毒螺旋体等少数菌种外，绝大多数细菌都可在人工培养基上生长，因此，培养构成细菌感染诊断方法的核心。根据培养的目的和步骤的不同，又可分为增菌培养、分离培养和纯培养。增菌培养为分离培养创造条件，目的是扩增拟分离培养的细菌，兼或抑制检样中的杂菌。纯培养是分离培养的目的，将分离培养获得的单一菌落继续扩大培养称为纯培养。获得纯培养才能检验其生物学、免疫学、致病性和药物敏感性等特征作出最后的诊断。细菌培养必须满足不同细菌的生长条件，这些条件包括气体环境、温度、培养基的组成和pH。生长条件也是实验诊断的指标，如被检细菌是需氧菌、微需氧菌、兼性厌氧菌还是厌氧菌；致病菌虽都属嗜中温细菌,最适生长温度在35℃～45℃之间。但因菌属不同仍有细微的差别，耶尔森菌属偏低，弯曲菌属偏高。多数细菌可在普通营养肉汤和营养琼脂上生长；有些细菌如奈瑟菌属、嗜血杆菌属、弯曲菌属、棒状杆菌属和分枝杆菌属营养要求较苛刻，要附加血液成分、氨基酸、维生素、微量元素等特殊生长因子。特别是军团杆菌属细菌只能在含有半胱氨酸和有机铁化合物成分的培养基上生长，又常需用活性炭或淀粉吸附培养基中阻碍发育的毒性物质。因此分离的可疑菌落同时接种专用培养基和普通琼脂，如在两种培养基上都生长就可排除军团杆菌，只在专用培养基上生长则可进一步作种或血清型的鉴定。

（一）培养基的配制

培养基是人工地将多种物质按各种细菌生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种细菌。因此，营养基质应当有细菌所能利用的营养成分，包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。还要求适当的pH范围。不同细菌对pH的要求不一样，所以配制培养基时，要根据不同细菌对象用稀酸或稀碱将培养基的pH调到适宜的范围。但配制pH低的琼脂培养基时，如预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解而不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌后，再调pH。

此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，以防止其中的微生物生长而消耗养分和改变培养基的pH而带来不利的影响。

（二）细菌的培养与接种

1．分离培养——平板接种法

细菌在自然界及人体中分布广、种类多，因此临床上检测各种检验标本中是否有某种病原菌时，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。常用平板分区划线法。方法如下：①烧灼接种环，待冷(约等待3s～5s)，取一接种环检验标本。②左手抓握琼脂平板培养基并靠近火焰。右手握持沾菌的接种环，使接种环面与平板表面成30^Ｏ～40^Ｏ角。在琼脂平板上来回划线，涂成一薄膜(约占平板总面积的l／10)。划线时以腕力在平板面上作轻快的滑移，接种环不应嵌进培养基内。③烧灼接种环以杀灭环上留剩的菌液。待冷(环是否冷却，可先在平板培养基的边缘空白处接触一下，若琼脂溶化表示尚未冷却，宜再稍等,复试之)。将环通过薄膜处作连续划线(约占划线的1/5～1/6)，划毕再用火焰灭菌。冷后作同样的划线，共计4次～5次。④划线完毕，接种环灭菌后放回原处，盖上平板盖。将平板倒置放入培养箱培养，这样可避免培养过程中凝结水自平板盖滴下，冲散菌落。⑤37℃培养18h～24h后取出，观察琼脂平板表面生长的各种菌落，注意其大小、形状边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。

2．纯培养接种法

（1）平行划线法

也称密集划线法，属于增菌培养方法。培养物可用于做紫外线杀菌试验、药敏试验等。步骤如下：①接种环烧灼灭菌后取细菌培养物少许。②左手抓握琼脂平板培养基并靠近火焰周围。右手握持沾菌的接种环在琼脂平板上连续平行划线于整个平板。将平板转动90^o，再连续平行划满平板。所划线条应致密而均匀，并达到平板的边缘，充分利用培养基的面积。接种环与琼脂间的角度不宜过大，以免划破琼脂。③划线完毕，接种环灭菌后放回原处，盖上平板盖。倒置放入培养箱培养18h～24h。

（2）斜面培养基接种法

步骤如下：①左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种管与待接种的培养基管，使菌种管位左，培养基管位右。斜面部均应向上，勿成水平，以免管底凝结水浸润培养基表面或甚至沾湿棉塞。②右手拇指和食指分别转动两管棉塞，以便接种时易于拔取。③右手执持接种环(姿势与握铅笔似)，烧灼灭菌，欲伸入试管内的接种杆部分亦要迅速通过火焰2次～3次以烧去表面的杂茵。灭菌过的接种环勿再碰及它物。④以右手手掌与小指、小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞，将两管管口迅速通过火焰数次灭菌。⑤接种环伸入菌种管，从斜面上桃取菌苔少许。退出菌种管，再伸进待接种的培养基管，自斜面底部向顶端轻轻划一直线，再由底向上婉蜒划线，慎勿划破培养基表面。沾菌的接种环，进出试管时，均不应触及试管内壁。⑥接种毕，接种环灭菌后放下。两管管口迅速通过火焰2次～3次，塞回棉塞，并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。培养18h～24h后观察生长情况。

（3）液体培养基接种法

步骤如下：①如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。②接种环灭菌冷却后，伸人菌种管挑取少量菌苔退出菌种管，再伸人肉汤管。在接近液面的管壁上轻轻磨研，再沾取少许肉汤调和。使菌混合于肉汤中。③接种完毕，接种环灭菌后放下。塞好棉塞，培养18h～24h后观察生长情况。

（4）半固体培养基接种法(穿刺接种法)

步骤如下：①如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种半固体琼脂培养基。②右手握接种针，灭菌冷却后，以针挑取菌苔。垂直刺入半固体琼脂培养基的中心直至接近管底（但勿触及）然后循原路退出。

（三）细菌培养性状观察

1．固体培养基上培养特征

用于分离培养和菌落形态观察的主要是各种组成成分的平板培养基。一个细菌经分离培养生长繁殖后形成菌落。菌落融合在一起叫菌苔。不同细菌的菌落各有特点，观察时应选择比较分散的菌落并注意以下几个方面：

（1）大小：以直径mm表示，1mm左右为小菌落，2mm～3mm为中等大小菌落，3mm以上为大菌落。

（2）形状：有圆形及不规则形状。

（3）边缘：有整齐或不整齐的边缘。

（4）表面：有凸起、平坦、光滑、粗糙、干燥、湿润之表面。

（5）透明度：可区别透明、不透明或半透明。

（6）颜色：产生脂溶性色素的细菌，菌落本身有颜色，有水溶性色素的细菌，菌落周围培养基也呈现颜色。

（7）溶血性：根据细菌对红细胞的溶解作用，有完全溶血、草绿色溶血及不溶血之分。

根据菌落的特点可分为光滑型菌落（S）型及粗糙型菌落（R）型两大类，前者为圆形、表面光滑、湿润、边缘整齐、透明，后者相反。

2．液体培养基中培养特征

蛋白胨水和营养肉汤或以此为基础加底物和指示剂做成生化试验用培养基。液体培养基接种纯菌种，适温培养，用以观察不同细菌的生长状态和酶活性。

（1）生长状态　均匀混浊或颗粒混浊为混浊生长现象，如葡萄球菌、大肠杆菌等。有表面平滑或皱折的菌膜，或有钟乳石样下垂等为表面生长现象，如枯草杆菌、结核杆菌等。生长液澄清，管底有菌体沉淀为沉淀生长现象，如链球菌等。

（2）酶活性　分解糖的终末产物，分解氨基酸的终末产物。现已被试剂盒逐渐取代。

3．半固体培养基中培养特征

半固体培养可观察细菌有无动力。无动力的细菌经培养后仅沿穿刺线生长，培养基清亮；而有动力的细菌，沿穿刺线向外散开，故穿刺线模糊不清，培养基变混浊。半固体也可作生化试验的基础培养基，用于厌氧菌的检验。

细菌培养是检验过程的第二阶段，一旦获得分离培养的可疑菌落后常辅以镜检和玻片凝集试验，并和原检样镜检的结果对照，据此作出更准确、更进一步的结果报告。

表2-5-2　培养特征明显的病原菌

菌种	条件	特征
鼠疫杆菌	营养琼脂30℃～37℃48h，	菌落中心凸，粘稠，可整体推移
霍乱弧菌	碱性琼脂37℃16h～18h	菌落圆形，扁平，透明，光滑，湿润
白喉杆菌	亚碲酸盐血琼脂37℃24h～48h	重型菌落：中心灰黑，呈放射纹 中型菌落：灰黑，光滑或微粒 轻型菌落：深灰至黑色，光滑，有光泽
炭疽杆菌	营养琼脂37℃16h～18h 肉汤培养37℃16h～18h	菌落粗糙，粘性，卷发样边缘 絮状沉淀，上液澄清
结核杆菌	罗氏培养基37℃2周～3周	菌落干，粗糙，颗粒状，不透明
葡萄球菌	营养琼脂37℃18h～24h	菌落圆形光滑，边缘整齐，非水溶性色素
类鼻疽杆菌	4%甘油琼脂37℃48h	菌落粗糙皱折，黄褐色偶有乳白色，霉臭味
大肠杆菌	麦康凯琼脂37℃18h～24h	菌落光滑圆整，湿润、粉红色，有异臭味
产气荚膜杆菌	血琼脂37℃24h～48h厌氧	菌落光滑圆整，不透明，双层溶血

二、代谢产物的检查

各种细菌具有的酶不完全相同，因而代谢产物有别，用生物化学方法检测这些代谢产物，有助于鉴别细菌。这种生物化学方法简称生化反应。这里介绍生化反应主要类型及方法。

(一)糖代谢试验

1．糖发酵试验

原理糖发酵试验是最常用的生化反应，是检查细菌能否分解糖、分解糖的类型以及产物的试验。本试验是将葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等分别加入蛋白胨水培养基中，使其最终浓度为0.75%～1%，并加入一定量的指示剂及一只小倒管。接种细菌并孵育一定时间后，若该细菌具有分解某种糖的酶，分解产酸就会使指示剂变色。指示剂为酸性复红则变成红色；为溴甲酚紫则呈黄色。若有气体生成，则小倒管里有气泡生成。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是他们在分解糖的能力上有很大差异。有些细菌能分解某种糖并产酸产气，有些细菌只产酸不产气。这在肠道细菌鉴定上尤为重要。大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

方法将伤寒杆菌、大肠杆菌和普通变形杆菌分别接种于两管糖发酵管中，37℃培养18h～24h观察结果。

结果首先确定细菌是否生长，细菌生长则培养基变浑浊，糖是否被分解根据以下判定。①培养基未变色，小倒管内无气泡，表明不产酸不产气，糖未分解，记录结果以“―”表示；②培养基变红(或黄)，小倒管内无气泡，表明产酸不产气，以“+”表示；③培养基变红(或黄)，小倒管中有气泡，表明产酸产气，以“⊕”表示。

2．Voges-Proskauer二氏试验简称VP试验

原理某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下，被氧化生成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物。

方法将大肠杆菌和伤寒杆菌分别接种于蛋白胨水中，37℃培养18h-24h；分别在培养液中加入VP试剂（肌酸或肌酐0.3g溶于40%KOH水溶液100ml中），混匀，静置观察。

结果若表层试剂呈现红色为阳性。

3．甲基红（methylred）试验

原理某些细菌分解葡萄糖产生的丙酮酸，使培养基pH﹤4.5，甲基红指示剂呈红色，若丙酮酸进一步脱羧，生成中性的乙酰甲基甲醇，甲基红指示剂呈橘黄色。

方法将大肠杆菌和伤寒杆菌分别接种于蛋白胨水中，37℃培养18h～24h，加甲基红指示剂（甲基红0.02g溶于60ml95%酒精中，再加水40ml）数滴。

结果呈红色的为阳性，呈黄色的为阴性。如为阴性则继续培养4d～5d再行试验。

（二）蛋白质代谢试验

1．吲哚(indole)试验

原理有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚。吲哚无色不能直接观察。加入柯氏试剂，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与吲哚作用后形成红色的玫瑰吲哚，易被肉眼识别。

方法将大肠杆菌和伤寒杆菌分别接种于蛋白胨水中，37℃培养18h～24h，于每管中滴加柯式试剂（5g对二甲基氨基苯甲醛溶于150ml95%酒精中，再加浓盐酸50ml）数滴，使成一薄层于液面上，轻轻摇动试管。

结果表层试剂呈现红色为阳性，呈黄色为阴性。

2．硫化氢试验

原理某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢。硫化氢遇铁（如硫酸亚铁）或铅离子（如醋酸铅），则形成黑褐色的硫化铁（或硫化铅）沉淀物。黑褐色沉淀物愈多，表明生成的硫化氢的量愈多。硫化氢试验用的培养基中含有硫代硫酸钠，它是一种还原剂，保持还原环境，使形成的硫化氢不再被氧化。—般穿刺于培养基贴管壁处而不是培养基中央。本试验常用于肠杆菌科细菌种的鉴定和布氏杆菌的分型。

方法分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌于醋酸铅培养基中，37℃培养18h～24h。

结果穿刺线处呈黑色者为阳性，不变色者为阴性。

3．尿素酶试验

原理具有尿素酶的细菌分解尿素，形成氨，使培养基呈碱性。所以指示剂酚红变成红色。

方法将大肠杆菌、变形杆菌分别接种于尿素培养基，37℃培养18h～24h。

结果培养基变红为阳性，因阴性仍为黄色。

（三）盐类代谢试验

枸橼酸盐试验

原理某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，并分解培养基中的铵盐生成氨，使培养基碱性增加，若培养基中的指示剂为溴麝香草酚蓝，则由淡绿变为深蓝。

方法将大肠杆菌和产气杆菌分别接种在枸橼酸钠斜面上，37℃培养24h～48h，观察培养基变化。

结果培养基变为深蓝，为试验阳性。

以上介绍的实验中，其中吲哚（I）、甲基红（M）、VP（Vi）、枸橼酸盐试验并称为IMViC试验，常用于肠道杆菌的鉴定。例如，大肠杆菌、产生杆菌这四种试验的结果分别为“++--”、“--++”。此外，产氨试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验也常用于细菌的鉴定。

近年来，细菌学已普遍采用微量、快速的生化鉴定方法。例如，微量生化诊检卡，它是将各种不同的脱水试验培养基和指示剂吸附于滤纸片上或直接加入特殊的分隔室里，加入某一试验菌液，培养后即能得到反应结果，可用来对试验菌进行诊断与鉴定。国际上广泛使用的APL—2F系统（AnalytabProductsLinc)。它有20个塑料分隔室，即含20种同的脱水培养基，每一分隔室可进行一种生化反应，个别室可进行两种生化反应，主要用来鉴定肠道杆菌科细菌。国内研制的E-15系统，有15个分隔室，各含一种供不同生化反应的脱水试验培养基，不但可作肠道菌的微量生化鉴定，而且能诊检其它微生物。与常规生化反应鉴定方法相比，它具有快速、准确、重复性好、操作简单，在人力、物力、空间上经济节约等优点。此外，VITEK全自动细菌鉴定、气相或液相色谱均可快速确定细菌种类。

三、外界因素对细菌的影响

细菌和其他生物一样，其生存与外界环境关系极为密切，适宜的环境能促其迅速生长繁殖，否则，细菌代谢发生障碍，或菌体蛋白变性凝固，导致生长受到抑制，甚至死亡。根据这一特点，采用人工方法，清除或杀灭病原微生物，促进有益菌生长，以保证生产和科研免受杂菌干扰。抑制方法很多，根据实际需要，主要有物理、化学和生物的方法。

（一）物理因素对细菌的影响

1．热力

原理高温能使菌体蛋白质变性凝固，对细菌有明显的杀灭作用。根据加热的方式不同，又可分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌主要指灼烧灭菌法和干烤灭菌法。湿热灭菌方法主要包括高压蒸汽灭菌法、煮沸法、巴氏消毒法和间歇蒸汽灭菌法等。高压蒸汽灭菌法最常用。适用于一般培养基、玻璃器皿，无菌缓冲液，手术敷料及传染性标本等的灭菌。它是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，而增加灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白凝固变性而达到灭菌的目的。在同—温度下，湿热的杀菌效力比干热大。每1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ(千焦)的热量，这种潜热能迅速提高被灭菌物体的温度。湿热的穿透力大，使菌体蛋白较易凝固，从而增加灭菌的效力。

方法

（1）灼烧灭菌法即利用火焰直接把细菌杀死，灭菌迅速，但适用范围有限，常用于接种环、试管口等的灭菌。

（2）干烤灭菌法即利用干烤箱灭菌，一般加热至160℃～170℃维持2h，但不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉花就会烤焦，甚至引起燃烧。该方法适用于耐高温物品，如玻璃器皿（平皿、试管、吸管、玻瓶）等等。其优点是可使灭菌物品保持干燥。使用方法：①要灭菌的玻璃器械应先洗涤晾干（如有水，易破裂)，吸管、平皿都可用纸包，试管、玻璃瓶也可用棉塞；②放置物件不可太密，以免内部热度不均；③各物件放置妥当后，即可关门加热．此时顶部活门应外放，使冷气逸出，待热度上升至60℃时，将活门关闭，使温度逐渐上升，一般需150℃～160℃1h～2h，即可使芽胞、繁殖体全部杀死；④待热度降至60℃左右，方可开门取物，否则玻璃有炸裂危险。

如果将温度上升至100℃维持1h，只能使玻璃器皿干燥，达不到灭菌要求。

（3）煮沸菌法在煮沸条件下，一般细菌的繁殖体5min能被杀死，芽胞需煮沸1h～2h才被杀灭，常用于手术器械等的消毒。

（4）高压蒸汽灭菌法①首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。②放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿高口的纸而透入棉塞。③加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏水。④用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排出锅内的冷空气，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。一般物品的灭菌常在101kPa121℃20nin的条件下灭菌。⑤灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可使用。注意事项：①灭菌时人不能离开工作现场，控制热源维持灭菌时的压力。压力过高，培养基的营养成分会被破坏，严重者将会导致高压锅爆炸造成伤人事故。②在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷气的排除是否完全极为重要。因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同—压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。③一般培养基在101kPa121℃20min的条件下可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例如为了保证含糖培养基的营养，只能在49kPa112℃15min的条件下灭菌。但为了保证效果，可将其他成分先行101kPa121℃20nin灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。又如盛于试管内的培养基以101kPa121℃20nin灭菌即可,而盛于大瓶内的培养基最好以101kPa121℃30nin灭菌。④蒸汽压力现行的法定单位为Pa或kPa，但目前实验室常用的高压蒸汽灭菌锅（有立式、卧式和手提式等几种）上的压力表所用单位为kg/cm²或lb/in²(磅／英寸²)三者之间的换算关系见表2-5-3。

表2-5-3蒸汽压力与蒸汽温度换算关系

大气压力	kg/cm2	1b/in2	kPa	℃
1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.50 3.00	0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.50 2.00	0.00 3.75 7.50 11.25 15.00 22.50 30.00	0 25 49 172 101 147 203	100.0 107.0 112.0 115.0 121.0 128.0 134.0

2．过滤除菌

是用过滤方式除去液体或气体中的细菌，以达到除菌的目的。所用的器皿是滤菌器，其孔经细小，其滤板由陶瓷、硅、藻土或石棉等制成，可截留细菌，适用于一些对热不稳定的液体（糖溶液、血清、腹水、某些药物等）和气体等除菌，也可用来分离细菌和病毒、细菌和其它毒素等。滤菌器种类很多，目前常用的为滤膜滤菌器。

滤膜是由醋酸纤维或硝酸纤维素等物质构成，厚度约为0.1mm，置于滤器上，抽气过滤。滤膜过滤器耐热，可经高压蒸汽灭菌，分上下两节，用螺旋旋紧的方法将滤膜夹在上下两节之间，两节滤器各有导管，待滤液自上导管经滤膜流至无菌瓶中。已灭过菌提供一次性使用的滤膜滤菌器，尤其适用于无菌要求特别高的医药部门和科研单位。

3．对细菌的作用

原理紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为200nm～300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线杀菌机制主要是因为诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O₂氧化成臭氧O₃或使水(H₂O)氧化生成过氧化氢H₂O₂，O₂和H₂O₂均有杀菌作用。

此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内(或接种箱内)喷洒3%～5%的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%～3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外线灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。

方法①用记号笔将琼脂平板分为二部分。用接种环沾取大肠杆菌或枯草杆菌菌液多环。分别在琼脂平板培养基上来回密密涂满。②将分别涂满二菌的琼脂平板用皿盖盖住一半后。(二菌应都被遮去1/2)在离紫外线灯1.2m处，直接受紫外线照射30min。然后盖好皿盖，37℃孵育24h后观察生长情况。

注意事项：紫外线穿透力不大，只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。

结果用皿盖遮住的一半培养基有细菌生长，没有遮住的另一半培养基无细菌生长，说明细菌已被杀死。

（二）化学因素对细菌的影响

许多化学药物能使细菌蛋白质变性，阻碍其生理活动，导致细菌生长受抑制或死亡。根据实际需要，分别起到消毒、防腐、灭菌的目的，其效果与化学药物的浓度、外界环境及细菌本身有密切关系。绝大多数消毒剂在高浓度时杀菌作用大，当浓度降至一定浓度时只起抑菌作用，但醇类例外，70%乙醇或50%～80%异丙醇消毒效果最佳，碱性染料龙胆紫对革兰阳性菌的灭菌效果比革兰阴性菌好。

（三）生物因素对细菌的影响

对细菌有影响的生物因素有抗生素、中草药及噬菌体等。抗生素的抗菌机制有多种。有的能干扰细菌细胞膜的功能；有的能抑制细菌细胞壁的合成；有的影响蛋白质或核酸合成。近年来，由于抗生素的广泛使用，致使大量耐药菌株生成，造成了不良后果。细菌对抗菌药物敏感性试验简称药敏试验，可指导临床用药，提高疗效。

细菌的药敏试验方法很多，有纸片琼脂扩散法(Kirby-Baucr法)、试管稀释法、牛津小杯法和平板小沟法等，在此主要介绍常用的纸片琼脂扩散法。

原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种检测菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物收取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内检测菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对检测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。采用标准菌株控制影响药敏结果的可变因素

表2-5-4抗菌药物的抑菌圈与敏感标准

抗生素	每纸片含药量	抑菌圈
		耐药	中度敏感	敏感
青霉素G	10μg	≤20	12～28	≥29
链霉素	10μg	≤11	12～14	≥15
庆大霉素	10μg	≤12	13～14	≥15
红霉素	15μg	≤13	14～17	≥18
四环素	30μg	≤14	15～18	≥19
多粘霉素B	300μg	≤8	9～11	≥12
卡那霉素	30μg	≤13	14～17	≥18
氯霉素	30μg	≤12	13～17	≥18
磺胺	30μg	≤13	13～16	≥18

方法①取琼脂平板培养基2块，分别于其底部玻璃上注明金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌。②将二菌菌液分别涂于上述两个培养基平板上。③镊子经火焰灭菌，摄取各药物药片，分别贴于涂有细菌的培养基平板表面相应位置上。④置37℃孵育18h～24h，观察纸片周围有无抑菌圈，并比较抑菌圈的大小，判断细菌对抗生素的敏感度。

结果用精确度1/10mm的游标尺量抑菌圈直径。查表即可得出该菌对某药是敏感（S）、中度敏感（I）或是耐药（R），如表2-5-4。

三、细菌的变异

细菌生存与环境关系密切。当条件发生变化时，细菌虽可生存，但往往其形态、生理、致病性等方面发生改变。

（一）形态的变异

原理细菌在一定的环境下有相对稳定的形态和结构。外界环境改变可引起形态变异。如将无毒鼠疫杆菌培养于含高盐的培养基中，可出现大小不等的多形态；又如将某些菌孵育于含青霉素的培养基中，经过一定时间后可发生型L变异。

方法①接种鼠疫杆菌于3%～6%于氯化钠血琼脂斜面上。②28℃～30℃孵育3d，取出作涂片，革兰氏染色后与未变异株的示教片作对比观察。

结果鼠疫杆菌在3%～6%于氯化钠血琼脂斜面上生长的鼠疫杆菌呈现大小不等的多形态。

2.鞭毛的变异

原理有鞭毛的细菌如变形杆菌，在培养基表面可形成迁徙生长性菌苔，如培养在含0.1%石炭酸培养基上，细菌不能产生鞭毛，没有迁徙现象而呈现单个菌落。

方法①分别在琼脂平板和0.1%石炭酸琼脂平板的中心用接种针点种变形杆菌，勿将细菌划开。②37℃孵育24h后观察菌落有无迁徙现象。

结果变形杆菌在0.1%石炭酸琼脂平板上无迁徙现象。

3.细菌耐药株的筛选

原理链霉素敏感株在含50U/ml链霉素的琼脂平板上一般不出现菌落，如有菌落出现则为耐药株。

方法①在灭菌培养皿底部的一侧垫放—定厚度的木块，使之倾斜。倾注入已加热熔化的TSB培养基（胰酪胨17.0g，蛋白胨3.0g，NaCl15.0g，KH₂PO₄2.5g，加水至1000ml,调整至pH7.4），使培养基恰好覆盖整个培养皿底部。待TSB培养基凝固后，将培养皿平放。加链霉素溶液至另一经加热熔化并冷至60℃左右的TSB培养基中，使终浓度为62.5U／m1。充分混合均匀后倾注于上一培养皿的固体培养基表面。这样链霉素梯度琼脂平板就制备好了。②滴加0.3ml金黄色葡萄球菌(链霉素敏感株)肉汤培养液至梯度琼脂平板表面，使覆盖整个平板表面，片刻后吸去多余菌液（此步骤也可用棉拭粘菌液后涂布），37℃孵育24h。③高浓度链霉素区琼脂平板上出现的菌落即为耐药菌落。④挑取高链霉素浓度区的菌落至TSB培养基中制成菌落悬液。从此悬液中各取一接种环，分别接种至TSB培养基和另一含50U/ml链霉素的TSB中，另取原来对链霉素敏感的金黄色葡萄球菌菌液分别接种至上述两种培养基中作为对照。            ⑤37℃    培养24h后，取出，观察各管生长情况。

结果金黄色葡萄球菌（链霉素敏感株）在琼脂平板的高浓度链霉素区有菌落出现则为耐药株。

4．细菌的耐药性变异，R因子传递试验

原理大肠杆菌与痢疾杆菌的新陈代谢不同。前者能分解乳糖产酸，在SS培养基上使指示剂（中性红）显色。菌落为粉红色、不透明。痢疾杆菌不能分解乳糖，因而在SS平板上菌落为无色、透明。若耐药的大肠杆菌菌株的R因子能将耐药特性通过与敏感的痢疾杆菌共同孵育直接接触而传递给后者，痢疾杆菌即可获得耐链霉素的性能。耐链霉素的痢疾杆菌可在含链霉素的平板上生长繁殖，表现为半透明无色菌落，对这类菌落还需按肠道杆菌必要的鉴定步骤予以鉴定，以明确是否为突变耐药株。

方法将耐药的大肠杆菌与敏感的弗氏痢疾杆菌分别移种于两支普通培养基中，培养12h，然后吸取1份大肠杆菌培养液加4份痢疾杆菌培养液，混合于一无菌试管中37℃30min～60min,用棉签沾上述混合液涂布SS平板上，37℃培养18h～24h后，观察细菌菌落情况。

第三节病原性球菌的实验技术

临床上常见的化脓性疾病，大都由病原性球菌引起，其中包括G⁺菌（如葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等）和G^—菌（如脑膜炎球菌、淋球菌等）。

一、形态染色

1．葡萄球菌球形或略呈椭圆形。典型的葡萄球菌排列呈葡萄串状。在浓汁或液体培养基中生长者，常为双球或短链状，无鞭毛，无芽胞。幼龄培养物可见荚膜。菌体易被碱性染料着色，G⁺；当衰老、死亡或被中性粒细胞吞噬后常常转为G^—。在青霉素等药物影响下，可诱导成L型。

2．链球菌球形或椭圆形，呈链状排列，长短不一，从4个～8个至20个～30个菌细胞组成不等。临床标本中，以成对、短链多见；在液体培养基中形成的链状排列常比取材于固体培养基上者长。无芽胞。无鞭毛。多数菌株在培养早期（2h～4h）形成透明质酸构成的荚膜，随着培养时间的延长，因菌自身产生的透明质酸酶而逐渐被分解消失。有菌毛样结构，含型特异的M蛋白。链球菌易被普通的碱性染料着色。自病灶新分离株为G⁺，若培养日久的老龄菌或被中性粒细胞吞噬后，可变为G^—。

3．肺炎球菌G⁺双球菌，菌体呈矛头状，宽端相对，尖端向外。在痰液、脓汁、肺组织病变中亦可呈单个或短链状。无鞭毛。无芽胞。有荚膜，第3、8和37型菌的荚膜厚。易被普通碱性染料着色，陈旧培养菌常呈G^—，或因该菌能产生自溶酶而只有G^—菌体残骸。荚膜须特殊染色才可见。

4．脑膜炎球菌肾形或豆形G^—双球菌，两菌接触面平坦或略向内陷。在患者脑脊液中，多位于中性粒细胞内，形态典型。新分离菌株大多有荚膜。人工培养后可成卵圆形或球形，排列较不规则，单个、成双或4个相连等。在孵育24h后的培养物中，常呈现衰退形态，菌体大小较不一致，着色亦深浅不匀。

5．淋球菌形态染色与脑膜炎球菌相似，常成双排列，两菌接触面平坦，似一对咖啡豆。脓汁标本中，淋球菌常位于中性粒细胞内，但分布不甚规则，从0个～50个或更多。无芽胞。无鞭毛。有荚膜和菌毛。

二、培养特性

1．葡萄球菌在普通琼脂平板上孵育24h～48h后，可见单个菌落。为中等大小、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明、脂溶性色素较明显。菌落初呈白色，随后因种不同，金黄色葡萄球菌呈金黄色，表皮葡萄球菌呈白色，腐生葡萄球菌大多呈柠檬色。

在血琼脂平板上，金黄色葡萄球菌菌落周围有明显的溶血环，而表皮葡萄球菌无溶血环（但少数新分离的白色葡萄球菌可有微溶血现象）。其余特点与普通琼脂平板上菌落基本相同，唯色素不太明显。

2．链球菌在血琼脂平板上菌落均为灰白色的细小菌落。甲型链球菌菌落周围有较窄的草绿色溶血环（不完全溶血，即α溶血）。乙型链球菌菌落周围可见较宽界限分明、宽而透明的溶血环（完全溶血，即β溶血）。丙型链球菌不产生溶血素，菌落周围无溶血环。

3．肺炎球菌在血琼脂平板上的菌落与甲型溶血性链球菌很相似，细小、灰白色、圆形略扁、半透明、直径0.5mm～1.5mm，有α溶血环。若孵育时间>48h，肺炎球菌产生足量的自溶酶，菌体渐溶解，菌落中央下陷呈脐状。

4．脑膜炎球菌在巧克力平板上形成圆形、凸起、光滑、湿润透明、无色素、边缘整齐、似露滴状的菌落，直径为1.0mm～1.5mm。

5．淋球菌在巧克力平板上35℃48h培养后，菌落呈圆形、凸起、无色或灰白色、直径0.5～1.0mm的光滑型小菌落。

三、鉴定试验

（一）血浆凝固酶试验

原理大多数致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，而非致病株一般不产生。因此，血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标。葡萄球菌产生的血浆凝固酶有两种：一是游离凝固酶，能被血浆中的协同因子激活为凝血酶样物质，使液态的纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，从而血浆凝固。二是结合凝固酶，为纤维蛋白原受体，附着于细菌表面，与血浆中的纤维蛋白原交联而使细菌凝聚。

方法一（玻片法）①取洁净的载玻片一张，分左右两区，左区为生理盐水对照。在两区中间各加一滴生理盐水。②取金黄色葡萄球菌菌落混悬于玻片上的生理盐水内，研磨均匀。③于右区细菌悬液内加入未稀释的兔血浆一滴，混匀。④轻轻摇动玻片，立即观察结果。

结果若细菌聚集成团块，无法混匀为试验阳性；若无细菌凝聚则为阴性。生理盐水对照侧应为均匀的混悬液。

方法二（试管法）取华氏试管3支，各加1:4稀释的新鲜兔血浆（或人血浆）0.5ml。在其中1支加待检菌的肉汤培养物0.5ml，另2支分别加凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物0.5ml作为对照。37℃30min观察1次，一般观察3h。

结果若试管内血浆呈胶冻状，此为血浆凝固酶阳性；若试管内血浆仍能流动，则为血浆凝固酶阴性。此法测定游离凝固酶。

（二）耐热DNA酶的测定

原理致病性的葡萄球菌产生一种耐热的DNA酶，能分解DNA，而非致病的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌，虽也能产生DNA酶，但均不耐热。因此，耐热酶测定可作为鉴定致病性葡萄球菌的一个指标。

方法一（玻片法）取融化好的甲苯胺蓝核酸琼脂3ml加到小孔6个～8个内，每孔再加入经沸水浴3min处理过的待检细菌和阳性、阴性菌株培养物各1滴，37℃3h，观察有无粉红色圈及其大小。

方法二（平板法）在有金黄色葡萄球菌菌落的平板上，选择试验菌落并标记，置于60℃干燥热力灭菌器2h，取出后每个平板倾注10ml融化的甲苯胺蓝核酸琼脂，37℃3h，观察结果。

结果产生耐热DNA酶的金黄色葡萄球菌周围呈粉红色圈。

（三）甘露醇发酵试验

将三种葡萄球菌分别接种于甘露醇发酵管，37℃18h～24h观察结果。致病性葡萄球菌多能发酵产酸，而非致病性葡萄球菌均不发酵甘露醇。

（四）肠毒素检测

原理致病性葡萄球菌能产生引起食物中毒的肠毒素。此毒素是一种耐热蛋白质，通常100℃30min不被破坏。

方法一（动物试验）将金黄色葡萄球菌48h肉汤培养物煮沸30min，以杀死细菌并破坏其毒素，3000r/min1h后，取上清液2ml注射于猫静脉或腹腔（也可经口服上清液10～20ml）。若有肠毒素存在，通常在注射15min至2h内，幼猫发生呕吐、腹泻、体温升高、畏寒体颤等症状，4h～5h后逐渐恢复正常。

方法二（双向琼脂扩散试验）①用生理盐水配制1.2﹪～1.5﹪琼脂,加叠氮钠后最后浓度1:10000以防腐。②用吸管吸取已熔化的琼脂，直接加到载玻片上移动吸管直至载玻片上四个角上琼脂饱满为止，一块载玻片上约需3ml左右琼脂，加琼脂时应避免琼脂面上有气泡。③用内径3mm打孔器在琼脂中间打一孔，滴入肠毒素抗血清，周围打四个孔，分别滴入标准肠毒素（阳性对照）、液体培养基（阴性对照）以及待检标本，抗血清一般需作1:2或1:4稀释，抗原不稀释或作倍比稀释。④加好样的琼脂板置湿盒内，室温静置24h后观察结果。然后再放于湿盒中，室温24h后观察结果。⑤在阳性对照和阴性对照结果正确的前提下，若待检标本有明显白色沉淀线，即为阳性。

（五）抗链球菌溶血素O试验（ASO试验）

原理A群链球菌侵入人体可产生溶血素O，它具有很强的抗原性，感染后2周～3周，就能产生相应抗体（ASO）。试验时ASO高滴度的病人血清被定量的溶血素中和后还有ASO多余，这些多余的抗体即与ASO胶乳试剂反应，出现清晰、均匀的凝集颗粒，为阳性结果。本试验为体外中和反应，观察到的现象为间接凝集。ASO阳性表明患者不久前有链球菌感染，以辅助诊断风湿热，肾小球肾炎等疾病。

凝集（＋）

（病人血清+溶血素O）+胶乳试剂

不凝集（－）

注：胶乳试剂系羟化聚苯乙烯胶乳与溶血素O共价交联的产物。

方法（胶乳凝集法）在反应板上滴加已稀释的待检血清1滴（同时可作阴、阳性血清对照）。再滴加溶血素O溶液1滴，轻轻摇动2min，使其充分混匀后滴加ASO胶乳试剂1滴（用前摇匀），轻轻摇动8min（20℃）观察结果

结果有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。如将阳性血清进一步稀释（1:80），再重试，有清晰凝集者为强阳性。

（说明：阳性者相当于Todd溶血试验ASO≥500U，强阳性相当于Todd溶血试验ASO≥833U。）

第四节肠道杆菌的实验技术

肠道杆菌（entericbacilli）是一大群生物学性状近似的革兰阴性杆菌，常寄居在人和动物的肠道内，并可随人和动物排泄物广泛分布于土壤、水和腐物中。大多数肠道杆菌是肠道的正常菌群，但当宿主免疫力降低或细菌移位至肠外部位时，可成为条件致病菌而引起疾病；少数为病原菌，例如伤寒杆菌、痢疾杆菌、致病性大肠杆菌等。

一、形态染色

对疑有肠道杆菌的标本（如脑脊液、腹水等）或培养物（菌落、培养液等），均可涂片后进行革兰氏染色，在镜下可观察细菌的染色性、形态、排列方式、有无特殊结构等。大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、变形杆菌等肠道杆菌均为中等大小的革兰氏阴性杆菌，无芽胞，散在分布。

二、分离培养

肠道杆菌为兼性厌氧或需氧菌。营养要求不高，在普通琼脂平板上生长繁殖后，形成湿润、光滑、灰白色的直径2mm～3mm中等大小菌落（宋内志贺菌易形成粗糙型菌落）。在液体培养基中，呈均匀浑浊生长。

变形杆菌在普通平板上呈迁徙生长现象。

在分离培养肠道杆菌时，如标本中含有其它杂菌（如粪便），通常采用选择鉴别培养基，如SS、伊红美蓝培养基等。

（一）病原性肠道杆菌的分离鉴定步骤

粪便、肛拭选择鉴别培养基革兰染色、双糖铁培养基、生化反应

尿、脓汁血平板玻片凝集、药敏试验

血液增菌

报告结果

图2-5-1病原性肠道杆菌的分离鉴定步骤

（二）SS琼脂平板的制备

原理SS琼脂培养基为分离肠道病原菌的强选择鉴别培养基。培养基中除含有营养物质外，还有胆盐、煌绿、硫代硫酸钠和枸橼酸钠等化学试剂，这些物质能抑制非致病菌（大肠杆菌）生长，而胆盐又有促进沙门氏菌、痢疾杆菌生长的作用。此外SS琼脂培养基中还加有乳糖和中性红指示剂（酸性时为红色，碱性时呈黄色）。

方法称取SS琼脂培养基干粉10.6g置烧杯中，加水200ml，将烧杯放置电炉上加热，边加热边用玻棒搅拌，待培养基干粉完全溶解后，稍冷，倾注于灭菌玻璃平板中（15ml～20ml/只）。待琼脂凝固后可用于分离培养。

结果肠道致病菌不分解乳糖，所以在SS琼脂平板上生长的菌落为无色或微黄色光滑型小菌落。乙型副伤寒杆菌、变形杆菌能产生H₂S，形成的菌落中心呈黑色。大肠杆菌在SS琼脂平板上一般不生长，但如粪便标本接种得多，大肠杆菌量多，仍可生长。大肠杆菌能发酵乳糖产酸，所以在SS琼脂平板上形成红色较大的光滑型菌落，很容易与致病菌区分。

（三）粪便标本中肠道致病菌的分离

<,DIV>用无菌接种环挑取少量标本（注意灭菌后接种环要冷却），分四区划线接种于SS琼脂平板上。注明标本编号、班级、姓名及接种日期等。置37℃培养18h～24h，观察菌落特征。

三、肠道杆菌的鉴定

（一）生化反应

肠道杆菌生化反应活泼，能分解多种糖类和蛋白质，形成不同的代谢产物，常用生化反应以区别不同菌属和菌种。

1．几种主要肠道杆菌的生化反应

表2-5-5几种主要肠道杆菌的生化反应

内容   细菌	双糖铁			靛基质	半固体 （动力）	尿素
	上层 乳糖	下层 葡萄糖	H2S
大肠杆菌	+	+	-	+	+	-
伤寒杆菌	-	+	-/+	-	+	-
甲型副伤寒杆菌	-	+	-	-	+	-
乙型副伤寒杆菌	-	+	+++	-	+	-
痢疾杆菌	-	+	-	-	-	-
变形杆菌	-	+/+	+/-	+/-	+	+

注：“-”不发酵，“+”产酸，“+”产酸产气

2．克氏双糖铁培养基

该培养基用酚红作为指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖而产酸产气，使斜面与底层均呈黄色，且有气泡。如只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，因葡萄糖含量较少（占乳糖量的1/10），所生成的少量酸，可因接触空气而氧化挥发，并因细菌生长繁殖，利用含氮物质生成碱性化合物，使斜面部分变成红色。底层由于是在缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化挥发而仍保持黄色。如细菌分解蛋白质产生硫化氢，则与硫酸亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。

3．靛基质（吲哚）试验。详见本章第二节。

4．尿素分解试验。详见本章第二节。

目前临床上多用细菌生化反应诊检卡。详见本章第二节。

（二）动力试验

是观察细菌有无动力（鞭毛）的试验。取半固体培养基，用接种针穿刺接种细菌，37℃18h～24h观察结果。无动力的细菌沿穿刺线生长，穿刺线的外周培养基仍为清晰状。有动力细菌向四周扩散生长，使培养基变混浊。肠道杆菌多数有鞭毛，所以动力试验阳性。需注意的是痢疾杆菌无鞭毛，动力试验阴性。

（三）血清学试验

1．玻片凝集试验

原理抗原、抗体反应具有特异性，可用已知抗体（抗原）检测未知相应抗原（抗体）。细菌为颗粒性抗原，当与加入的诊断血清（含有特异性抗体）相对应时，在有适量电解质（生理盐水）存在下，可形成肉眼可见的凝集颗粒。

方法①取干净玻片一片，在左区滴加生理盐水1滴，右区滴加适当浓度的抗血清1滴（如伤寒诊断血清）。②用接种环取菌，分别加在玻片二区液滴内，并分别研磨均匀。③摇动玻片，经1min左右观察结果。

结果如该菌与抗血清相对应，则试验侧可见细小凝集颗粒，而盐水对照侧呈均匀混浊。

2．肥达试验（Widaltest）

原理用已知伤寒沙门菌菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及甲、乙型副伤寒沙门菌H抗原的诊断菌液，与不同稀释度的待检血清作定量凝集试验，测定受检血清中有无相应抗体及其效价，以辅助临床诊断伤寒及副伤寒。

方法①取微量反应板1块（10×4）。②稀释血清：用微量移液器吸取50μl生理盐水加入每行的1孔～10孔中，共4行。吸取1：10稀释的病人血清50μl分别加入各行的第1孔中，吸吹混匀后，吸50μl于第2孔中，混匀后再吸出50μl至第3孔中，以此类推，直至每行第9孔，混匀后弃去50μl，第10孔不加血清，作为生理盐水对照。③按表2-5-6加入各种成份：

振荡3min～5min，37℃恒温箱1h，观察结果。注意勿振荡反应板，以免凝块摇散。先观察对照孔，正确结果应无凝集反应，孔内液体均匀混浊或在孔底有一整齐的圆团。然后自第1孔开始依次观察至第9孔。根据反应的强弱，分别以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”符号记录。

表2-5-6血清学试验（肥达试验）方法

血清稀释度	（试验孔）每孔50μl							生理盐水 50μl
	1：20	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	1：1280
伤寒杆菌OAg	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl
伤寒杆菌HAg	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl
甲型副伤寒菌HAg	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl
乙型副伤寒菌HAg	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl	50μl
血清最后稀释度	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	1：1280	1：2560

结果“++++”：上层液澄清，细菌凝块全部沉孔底。“+++”：上层液轻度混浊，凝集块沉于孔底。“++”：上层液中等混浊，孔底有明显的凝集物。“+”：上层液体混浊，孔底仅有少量凝集物。“-”：孔内液体与对照孔相同，呈均匀混浊，无凝集现象。

效价判断：以能出现“++”凝集现象的血清最高稀释度为该血清的凝集效价。

结果分析：肥达试验结果的解释必须结合临床表现、病程、病史以及地区流行病学情况，尚须注意以下几点：①正常值正常人由于隐性感染或预防接种，血清中可含有一定量的抗体，其效价因地区而有差异。一般情况下伤寒沙门菌O凝集效价≥1：80，H凝集效价≥1：160，甲、乙副伤寒H凝集效价≥1：80才有诊断价值。②动态观察抗体在发病后一周左右出现，且随病程而增加。有时单次某一抗体效价增高不能定论，可在病程中逐周复查。若效价逐次递增或恢复期效价增高4倍或4倍以上，才有诊断意义。③O与H抗体在诊断上的意义人体感染伤寒、副伤寒或预防接种后，O与H抗体在体内的出现及消失情况不同。IgM型的O抗体出现早，持续时间短，消失后不易受非特异性刺激而重现。IgG型的H抗体出现较晚，维持时间长达数年，消失后易受非沙门氏菌等病原体刺激而短暂地重新出现（非特异性回忆反应）。因此，如O、H凝集效价均超过正常值，则伤寒或副伤寒的可能性大；若两者均低，患病可能性小；若O不高H高，有可能是预防接种或非特异性回忆反应（隔一定时间重复试验，若抗体效价不升高，则为非特异性回忆反应）；如O高H不高，则可能是感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有交叉反应的其他沙门菌（如肠炎沙门菌）感染。④其他有少数病例，在整个病程中，肥达试验结果始终在正常范围内。其原因可能由于早期使用抗生素治疗，或患者免疫功能低下等所致。

3．痢疾杆菌的免疫荧光菌球试验

原理抗原抗体的结合具有特异性，用荧光素标记的抗体与标本中相应的细菌抗原结合后可凝集成小球，在荧光显微镜下易被检出。

方法以无菌操作吸取1：30～1：100稀释的志贺菌荧光抗体（以蛋白胨水稀释），滴加在有划格载玻片上，分别滴加两滴。然后用接种环（内径2mm）挑取一满环被检材料（粪液或菌液等），接种于第一滴中。混匀后从其中挑一环至第二滴，摊开，置37℃湿盒内孵育6h左右，在荧光显微镜下观察结果。

结果如有形态结构清楚、亮度在+++”以上的荧光菌球一个以上为阳性。一般急性病例判定结果时，须要荧光菌球在数个以上。

（四）细菌的自动鉴定系统

细菌的自动鉴定需特殊仪器，我国引入的机型主要是AMS，商品全称是VITEKSYSTEM全自动化微生物分析仪。其自动化程度高，如反应部分即试验卡的进样和封口，培养过程变化的记录和分析，操作指令的输入，显示试验结果和结果打印的过程都是自动进行的。可直接从标本诊断特殊细菌。完成鉴定时间短，可在4h～24h准确鉴定出一般医院常见的致病菌。存在的问题是对标本中的不同细菌不能同时加以准确鉴定。主机昂贵和消耗品试验卡也要购入补充。适用于大型实验室。

（五）PCR

PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。此法操作比较简单，敏感性高，特异性好，可用于细菌感染的诊断。特别适用于一般临床症状由多种细菌引起或由一种细菌的不同类型引起的感染诊断。如可致腹泻的沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌和大肠杆菌的不同类型。

PCR的基本步骤是：检样处理→模板DNA制备→循环扩增→判读。出现和阳性对照平齐的DNA带为阳性，否则为阴性。

第五节分枝杆菌属、棒状杆菌属实验诊断技术

分枝杆菌种类很多，其中结核杆菌（人型、牛型）和麻风杆菌对人有致病性。结核杆菌是引起人和动物结核病的病原菌。麻风分枝杆菌是麻风病的病原菌，主要侵犯皮肤粘膜及外周神经组织，晚期更可侵犯深部组织和器官。

棒状杆菌是一群菌体细长、一端或两端膨大呈棒状G⁺杆菌，可以呈现多形态，排列呈栅栏状。用Albert染色法染色，菌体两端或一端有着色较深的异染颗粒。本属中对人致病的主要有白喉棒状杆菌。

一、结核杆菌

（一）形态染色

结核杆菌是一类细长略弯曲的G⁺杆菌,但一般不作革兰染色,多用抗酸染色。菌体经强染剂并在加温或延长染色时间的条件下可着色，着色后能抵抗强脱色剂盐酸酒精的脱色,又名抗酸杆菌。抗酸染色后菌体呈红色，背景呈蓝色。

（一）培养特性

将结核杆菌接种于罗氏固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2周～4周长成肉眼可见的干燥、粗糙颗粒状、乳白色或米黄色、凸起、形似菜花状菌落。液体培养可将结核杆菌接种于含血清的培养液，则可于1周～2周在管底见有颗粒生长。

（二）动物试验

将结核杆菌注射于豚鼠腹股沟皮下，3周～4周后若局部淋巴结肿大，结核菌素试验阳转，即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变，并作形态、培养等检查。

（三）快速诊断

多聚酶链反应(PCR)技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性结果，1d～2d可得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。另外，细菌L型由于缺乏细胞壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。

二、麻风杆菌

麻风杆菌革兰染色及抗酸染色均为阳性。菌体细长、稍弯曲，呈束状排列。经治疗后可呈多形态。一般瘤型和界线类患者的标本中可在细胞内找到细菌，有诊断意义。结核样型患者的标本中很少在细胞内中找到细菌。

三、白喉棒状杆菌

（一）形态染色

取白喉棒状杆菌涂片，革兰染色，镜检，可见白喉棒状杆菌呈紫色，菌体一端或两端膨大，排列散乱，如一堆火柴，或呈V、L、Y字形及栅栏状。Albert染色（详见第三章染色技术）可将菌体和异染颗粒染成不同的颜色，异染颗粒在鉴定细菌时有重要意义。

（二）培养特性

棉拭取标本接种于亚碲酸钾血平板（pH7.6营养琼脂100ml，10g／L亚碲酸钾水溶液2m1，50g／L胱氨酸水溶液2m1，脱纤维羊血或兔血5m1～10m1），37℃12h～18h培养，可见黑色菌落。白喉杆菌接种于吕氏血清斜面、鸡蛋斜面（将牛肉膏0.6g、蛋白胨2.0g、NaCl1.0g、葡萄糖2.0g与蒸馏水200m1混合，加热溶解制成葡萄糖肉汤，然后加入新鲜全蛋液750m1，通过双层纱布过滤，再加甘油50m1。注意，勿产生气泡。每支试管装入约3ml培养基，然后放入血清凝固器内使之成斜面，进行间歇灭菌。），经37℃培养12h～18h培养，则可长出灰色、微细、有光泽的圆形凸起菌落。

（三）Elek平板毒力试验

原理白喉杆菌毒素与白喉抗毒素相遇时可产生絮状沉淀，肉眼可见一条白色沉淀线。

方法①取培养基（蛋白胨4.0g，麦芽糖0.6g，乳酸0.14ml，水100ml。另取氯化钠1.0g，琼脂3.0g，水100ml。分别加热溶解、过滤矫正pH至7.8，两液混合、分装、灭菌）10ml加热融化，冷至50℃左右，加入经60℃30min灭活的正常马或兔血清2ml，混合后倾注平板。②待凝固后，在培养基的中央贴上60×15mm的滤纸条（事前在1000U/ml的白喉抗毒素中浸过），置37℃45min，以烘干表面水分。③将试验菌株和对照菌株在培养基上与滤纸条成垂直方向划线。④置37℃培养，于24h、48h、72h取出分别观察结果。

结果阳性者在纸条与细菌联接处两侧可见白色沉淀线。阴性者经72h培养仍无沉淀线产生。见图2-5-2

图2-5-2

第六节厌氧性细菌实验技术

厌氧性细菌多数必须在无氧环境下才能生长繁殖，少数可在微氧环境中生长，分为厌氧芽胞杆菌和无芽胞厌氧菌。厌氧芽胞杆菌引起人类疾病的主要有破伤风杆菌、产气荚膜杆菌、肉毒杆菌。

一、厌氧芽胞杆菌

（一）形态染色

三种杆菌均为G⁺。破伤风杆菌菌体细长，无荚膜，有周身鞭毛，芽胞正圆形，比菌体粗，位于菌体顶端，细菌呈鼓槌状。产气荚膜杆菌菌体粗大，无鞭毛，有明显荚膜，芽胞位于次极端，呈椭圆形，不大于菌体。肉毒杆菌菌体粗短，有鞭毛，无荚膜，芽胞位于次极端，呈椭圆形，粗于菌体，细菌呈汤匙状或网球拍状。

（二）培养特性

破伤风杆菌在血平板上培养48h后，可见薄膜状生长物，伴有β、α、θ溶血（透明溶血环2mm～4mm宽，界限分明）。肉毒杆菌为β溶血。产气荚膜杆菌在血平板上产生双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。均需厌氧培养法培养。

1．庖肉培养基厌氧培养法

原理由于庖肉培养基不含饱和脂肪酸，氧化时能消耗氧气而造成厌氧环境，故适于培养厌氧菌。

方法用灭菌接种环取破伤风杆菌接种至庖肉培养基（取牛肉渣0.5g，装于15×150mm的试管中，再加入pH7.6的肉汤培养基7ml。上盖3mm～4mm厚的融化凡士林，103.43kPa高压灭菌后备用。），37℃培养培养24h～48h观察结果。

结果培养液部分混浊，肉渣部分被消化变黑，稍有臭味。

2．焦性没食子酸厌氧培养法

原理焦性没食子酸在碱性溶液中能形成焦性没食子橙，可吸收空气中的氧气，造成缺氧环境，借以培养厌氧菌。

方法有平板法和试管法，这里介绍常用的平板法。用无菌接种环取产气荚膜杆菌，分区划线接种于血平板上，再在血平板上的盖子上覆盖少许棉花，加1g焦性没食子酸于棉花上，然后覆盖一块无菌纱布。再在纱布上滴加10%的NaOH约1ml，立即将种有细菌之平板反盖于平板盖上，并用溶化石蜡密封，置37℃温箱中培养24h～48h后，取出观察结果。

结果在血平板上可见双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。

3．“汹涌发酵”试验

原理产气荚膜杆菌能迅速分解牛乳中的乳糖，产生大量的酸，使酪蛋白凝固，将培养基表面的凡士林冲至试管口棉塞处，称为“汹涌发酵”现象，一般发生于培养6h～12h后。

方法用灭菌接种环取产气荚膜杆菌接种于溴甲酚紫牛乳培养基（将16g/L溴甲酚紫溶液0.1ml加入新鲜牛奶（脱脂）100ml中，分装试管，每管约5ml。于表面加已融化的凡士林，厚约5mm，55.16℃高压灭菌20min。），置37℃培养12h～24h，观察结果。

结果细菌分解乳糖产酸产气，酪蛋白凝固并形成海绵状碎块。

（一）动物试验（泡沫肝试验）

详见“动物实验技术”一章。

二、无芽胞厌氧菌

标本采集

无芽胞厌氧菌大多是人体正常菌群，采集标本时应取手术或活检标本、渗出液、脓液等，应从感染中心采取标本并注意避免正常菌群的污染，采集标本后应立即送入特制的厌氧标本瓶中，并迅速送检。

（二）直接涂片镜检

脓液标本可直接涂片后染色镜检，观察细菌的形态特性、染色性、菌量多少。

（三）分离培养和鉴定

标本采集后立即接种于庖肉培养基和牛心脑浸出液血琼脂平板（牛脑浸出液200ml，牛心浸出液250ml，磷酸氢二钠2.5g，半胱氨酸0.5g，眎胨10.0g，琼脂20.0g，酵母浸出液5.0g，氯化血红素(5mg/ml)1ml，葡萄糖2.0g，维生素K1(1%溶液)1ml，氯化钠5.0g，加蒸馏水至1000ml。103.4kPa高压灭菌15min，灭菌后pH为7.4，待冷却至50℃左右时加入5%～10%脱纤维羊血或兔血，混匀后倾注平板，4℃保存备用。），也可用疏基乙酸钠培养基，一式两份分别进行需氧和厌氧培养。培养后进行对比观察。如厌氧培养有菌生长，应立即转种，取得纯培养后，再作菌种鉴定。

（四）气相色谱法

检测细菌代谢终末产物中的脂肪酸和醇类，或将菌体裂解后测定其组成成分，能迅速正确地鉴定无芽胞厌氧菌的种类。

第七节病毒的实验技术

病毒性疾病十分常见。随着检测水平的提高，新的病毒性疾病还不断出现。快速、准确地进行病毒学检验有助于确诊病毒性疾病，并为流行病学制定有效的预防措施提供科学据。

诊断病毒性疾病的常用方法有：光学显微镜检查病毒的原生小体和包涵体；电子显微镜(EM)或免疫电镜(IEM)检查病毒颗粒；用鸡胚接种法、细胞培养法和动物接种法分离培养病毒；血清学试验有补体结合试验(CF)、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HAI)、中和试验(Nt)、免疫荧光试验(IF)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫试验(RIA)等检测病毒特异性抗原或抗体；分子杂交技术和多聚酶链反应(PCR)检测病毒的核酸，提高了快速诊断的敏感性，这些试验对检测那些用细胞培养法不能培养出来的病毒或生长缓慢的病毒特别适用。

一、标本的采集与送检

用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于-20℃。

二、病毒形态学检查

（一）用电镜检查病毒颗粒的形态及大小

在电镜下可见轮状病毒为60nm～80nm直径的球形颗粒，有双层衣壳，内衣壳的壳粒沿着病毒体边缘呈放射状排列，形同车轮的辐条。甲型肝炎病毒直径为27nm的球形颗粒，无包膜。由32个壳粒组成的衣壳，呈20面体立体对称。此种壳粒有空心和实心两种。实心者不易被染色液透入，空心者则易。详见“生物显微技术”一章。

（二）用光镜检查病毒包涵体

①风疹病毒包涵体为大的嗜伊红胞浆内包涵体，并可见嗜碱性核染色质聚集物。②麻疹病毒包涵体用感染了麻疹病毒的原代猴肾或人胚肾细胞作苏木精—伊红染色，可见嗜伊红的核内或胞浆内包涵体。③腺病毒包涵体腺病毒产生典型的核内嗜碱性福尔根阳性包涵体，其2型和3型均能在细胞培养中引起嗜碱性核内包涵体。④狂犬病毒包涵体狂犬病毒可在神经细胞(海马回)浆内形成圆形或卵圆形的嗜酸性包涵体。

三、鸡胚接种法

病毒的鸡胚接种法是用来培养某些对鸡胚敏感的病毒的一种方法，如分离培养流感病毒、乙型脑炎病毒等。根据不同病毒标本分别接种鸡胚尿囊腔、羊膜腔、绒毛尿囊膜、卵黄囊等。见图2-5-3。

图2-5-3

（一）准备鸡胚

孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内孵育（38℃～39℃，相对湿度40%～70%）。孵育3d后，鸡卵每日翻动1次～2次。第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况。未受精卵只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚形迹，这种卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，可以看见胚动。随后每天观察1次。将胚动呆滞或无运动的、血管昏暗模糊者(可能为已死或将死的鸡胚)随时淘汰。生长良好的鸡胚一直孵育到适当的胚龄。

（二）标本处理

采集的标本接种鸡胚前，一般需进行处理。如采集的鼻咽拭子标本应浸入5mlpH7.2肉汤或生理盐水中，待其自然沉淀。取上清液3ml，按每ml加青霉素1000IU、链霉素1000μg，混匀置4℃2h后接种鸡胚。若无细菌污染的标本，如脑脊液可直接接种鸡胚。

（三）接种方法

1．羊膜腔接种法取9d～11d龄鸡胚放入检卵灯下照视。画出气室及胎位。用碘酒消毒气室卵壳。在靠近胎位一侧用齿钻在气室顶端磨一等边三角形(边长约为1cm)的裂痕。用灭菌镊子揭去卵壳和壳膜，并滴一滴无菌液体石蜡在下层壳膜上，使其透明，以便在检卵灯下看得更清楚。

用灭菌尖头镊子，两页并拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜无血管的部位，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来。左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜。右手持带有26号针头的注射器（针头最好是无斜削尖端的钝头，以免刺伤鸡胚)。刺入羊膜腔内，注入标本0.2m1。

在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，立即盖上消毒盖玻片(或用浸有无菌蛋清的玻璃纸封住窗口)，气室朝上，放入孵育箱33℃～35℃孵育48h～72h。

收获前先将鸡胚放4℃冰箱6h或过夜，将鸡胚冻死以避免收获时出血。先用碘酒和酒精消毒气室，再用无菌镊子将气室以上卵壳去除，并把内面的壳膜和绒毛尿囊膜撕开，用无菌毛细吸管吸取尿液，然后左手持小镊夹起羊膜成伞状。右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水，每胚可收获0.5ml～1m1羊水放入无菌试管内。作无菌试验后，可直接作血凝试验和血凝抑制试验，也可保存于低温冰箱中备用。

2．尿囊腔接种法将鸡胚在检卵灯上照视，用彩笔画出气室和胚胎的位置，在胚胎面与气室交界的边缘上约1mm处或在对侧处，避开血管做一记号作为注射点。用碘酒、酒精消毒气室和记号处，用眼科手术刀(或消毒锥)在卵壳记号处打一小孔。注射器吸取病毒液。将针头垂直或斜行刺人膜内2mm，注入病毒液0.1ml～0.2ml。随即用透明胶带或石蜡封孔，然后将卵放人孵育箱内的卵盘上，33℃～35℃孵育48h～72h。

尿囊液收获和处理方法基本同羊水收获法。

3．卵黄囊接种法（略）

4．绒毛尿囊膜接种法（略）

四、组织细胞接种法

目前最常用的方法是细胞培养法。将经过处理的标本接种适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变，而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能因标本中病毒含量较低而未被检出。此时需盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离和鉴定病毒的全过程有时可长达两三个月，而且仅在有设备、实验室条件及合格工作人员的实验室方可进行。尽管这种方法需时长、步骤多，但在确定病原上是“金标准”，即其准确性高而无误。如欲提高病毒感染细胞的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶后，经低温离心，以增加病毒与细胞接触的几率。再将盖玻片进行培养，并用McAb染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。

（一）细胞病变效应（CPE）观察

取已生长的单层细胞培养瓶2瓶，弃去瓶中液体，用其中一瓶作为对照（不加病毒液），另一瓶滴加脊髓灰质炎病毒（疫苗株）悬液一滴，然后在两瓶中均按原量加入培养液（含10%小牛血清的Eagle液），盖紧，37℃孵育1d～2d，低倍镜观察细胞病变。

对照瓶无细胞病变。脊髓灰质炎病毒可引起细胞圆缩、堆积及脱落现象。通观整个“单层区”权衡总的情况，以下列符号表示其病变程度。

++++：3/4以上的细胞病变；+++：1/2～3/4的细胞病变；++：1/2的细胞病变；+：1/4以下有细胞病变。-：无细胞病变。

（二）血吸附的观察

取两瓶已生长成单层的鸡胚细胞培养瓶，弃去旧培养液，其中一瓶作为对照瓶（不加病毒液），另一瓶接种未灭活副流感病毒悬液0.01ml，然后两瓶各加新鲜的含10%小牛血清的Eagle培养液2ml，37℃孵育24h～48h。

最后用毛细血管吸去旧培养液，各瓶加入0.5%鸡红细胞0.2ml，摇匀，平铺于细胞层上，室温静置10min，用1ml冷Hanks液轻轻洗1次以除去未吸附的红细胞。镜检，如红细胞成片地吸附在细胞上则为血吸附试验阳性。对照瓶无吸附现象。

（三）病毒空斑测定

这是一种检查和滴定病毒的方法。病毒悬液稀释后接种至单层细胞，再在单层细胞上复盖半固体营养琼脂，病毒在感染细胞内复制产生一个局限性的感染灶，此灶随时间的延长而变大。经中性红染色，已感染的病变细胞不着色，在红色背景下呈现无色的“空斑”，一个空斑表示一个病毒颗粒在局部增殖的结果。病毒悬液的滴度可用每毫升空斑形成单位（plaqueformingunit，PFU）表示。病毒空斑测定步骤如下：

先将扁平小培养皿中致密成片的单层细胞，弃去旧营养液，加入10ml无血清Eagle培养液，37℃孵育1h，弃去培养液。用无血清的Eagle培养液稀释（1：10，1：100，1：1000，……）。接种于单层细胞中，每稀释度的病毒接种2个单层细胞小培养皿，接种量为0.2ml～0.5ml，37℃孵育1h。

再加44℃预温的Eagle营养琼脂100ml于细胞表面（厚度为1mm～2mm），平放1h待琼脂凝固（由于营养琼脂中含有中性红，应在暗室或红灯下进行。因为中性红为光动力活动性染料，遇光易产生毒性物质，故在光照下会影响空斑形成。当含有中性红琼脂加入感染的单层细胞表面时，必须置于黑暗处。一般营养琼脂在临用前配置）。数天后观察空斑，一般2d～3d开始出现点状，以后逐渐扩大成圈，扩大的空斑有的可融合成片。计算每ml病毒液空斑数的公式如下：

PFU/ml=空斑数/接种病毒的ml数×1/病毒的稀释度

五、动物接种法

动物试验是微生物学实验中的一项基本技术，常用于分离病原体，测定毒力，制备抗原、免疫血清及探讨发病机制等。动物实验的优点是发病与死亡指标明确，接种方法简单，为良好的实验模型。其不足在于它是一个开放的生物机体，易致污染，故管理麻烦，同时存在动物个体差异以及本身内源性病原体的干扰等。详见“动物实验技术”一章。

六、其它的病毒鉴定技术

鉴定临床上常见的病毒，除可用上述方法外，也可用免疫学方法测定病毒的抗原和特异性抗体，如EIA、IF和RIA等。近年来多聚酶链反应(PCR)等技术的发展，为临床病毒学的实验室诊断提供了一种简便、快速、敏感的方法，可以直接从各种临床标本中扩增某种待查的病毒核酸，使原来鉴定病毒需几周的时间缩短到几个小时，敏感性提高到pg水平。

七、常见病毒鉴定举例

（一）血凝试验

原理流感病毒表面的血凝素能与人的“O”型、豚鼠和鸡的红细胞上的血凝素受体结合，引起红细胞凝集。

方法①取洁净的4×5孔血凝板，每孔分别加入生理盐水，第1孔加0.4ml，其余各孔加入0.25ml（1份病毒悬液作10个孔）。②第1孔加入0.1ml病毒液，即1：5稀释。③用1ml吸管在第1孔内吹打3次后，吸取0.25ml加入第2孔，依此类推作倍比稀释至第10孔。最后，从第10孔中吸出0.25ml弃去。④每孔加0.25ml生理盐水。⑤每孔加0.25ml1%鸡红细胞悬液，摇匀，静置室温下30min后观察结果。（设红细胞对照孔：孔内先加入0.5ml生理盐水，再加入0.25ml红细胞悬液，此作为排除红细胞自身的非特异性凝集。）

结果++++：一层红细胞均匀铺在孔底。++++：一层红细胞均匀铺在孔底。+++：基本同上，但边缘不整齐，有下垂趋向。++：红细胞在孔底形成1个环状，四周有小凝集块。+：红细胞在孔底形成1个小团，边缘不光滑，四周有小凝集块。±：红细胞在孔底形成1个小团，但边缘光滑，四周似有小凝集块。-：红细胞在孔底形成1个小团，边缘光滑。血凝滴度以++为终点，即1个血凝单位。

（二）血凝抑制试验

原理某些病毒如流感病毒等悬液中加入特异性抗血清后，再加入人的“O”型、鸡或豚鼠的红细胞则不发生血凝现象，即为血凝抑制。此实验既可检测病人血清中的特异性抗体，又可用于病毒定型。

方法①根据血凝试验的结果，计算出病毒液4个单位血凝素，如1个血凝单位为1：640，则4个血凝单位为1：160。将病毒原液作1：160稀释即为4个单位血凝素。②取4×5孔洁净血凝板，每孔加入0.25ml生理盐水（每份血清作10孔）。③取已处理的1：5稀释血清0.25ml加入第一孔内，吹打3次后，吸出0.25ml加入第二孔内，如此倍比稀释至1：1280或更高（视效价而定）。病人血清先用霍乱滤液处理，以除去人血清中的非特异性抑制物。④每孔加入4个血凝单位的病毒悬液0.25ml。⑤每孔加入1%鸡红细胞0.25ml（如果加入4个血凝单位的病毒悬液后置37℃保温2h，再加入鸡红细胞，效价可提高4倍）。摇匀后置室温30min、45min各观察1次结果。以45min为准。如红细胞滑下，参考30min的结果。本试验设血清对照孔、病毒悬液对照孔和血球对照孔，在相同条件下观察结果。

结果根据红细胞凝集程度，确定血凝抑制滴度（效价）。以能完全抑制红细胞凝集的最小血清浓度（最高稀释度）为该病人的血凝抑制效价。

（三）ELISA（双抗体夹心法）检测HBsAg

原理ELISA是将抗原或抗体联结（包被）到某种固相载体（如聚苯乙烯或聚氯乙烯）表面，加入待检标本的抗体或抗原，再与酶标记的抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原抗体复合物起反应。因不同标本免疫反应不同，固经清洗后在固相载体表面留下不同量的酶，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检抗原或抗体量直接相关，固可根据颜色反应的深浅进行受检抗原或抗体的定性或定量分析。由于酶催化效率很高，因而极大地放大反应结果，从而使测定方法达到极高的敏感度。其测定方法分为间接法、双抗体夹心法和竞争法等。

方法①加样品及酶结合物在包被反应板条各孔内，依次加待检样品50μl，同时做两孔阴性对照，一孔阳性对照，一孔空白对照。然后每孔加酶结合物50μl（空白对照孔不加）。充分混合后将及时贴撕开，复盖在反应板上，置37℃保温30min。弃去及时贴及孔内反应物，用洗涤液洗板5次，吸干孔内液体。②显色各孔（包括空白对照）加底物A液50μl、B液50μl，置37℃保温10min。③终止反应各孔加终止液50μl，上机比色（或目测结果）。

结果将反应板置酶标比色计450nm处用空白孔校零点，读取各孔OD值。

计算：判断值=阴性对照平均OD值×2.1。

样品OD值大于判断值为阳性，小于判断值为阴性。

注：阴性对照OD值小于0.05按0.05计算，大于0.05按实际OD值计算判断值。

第八节真菌的实验技术

各种真菌的形态结构有其一定的特殊性，一般可以通过直接镜检和培养进行鉴定，但具体方法应根据标本种类和检查目的而定。

一、镜检

皮肤癣标本检查常用湿标本，不染色。假丝酵母菌感染则取材涂片，行革兰染色。隐球菌感染取脑脊液离心,沉淀物用墨汁作负染色后镜检。结果的判断：①直接检查阳性有意义，阴性不能排除感染。但阴道、痰等分离出假丝酵母菌、曲霉等条件致病菌需多次阳性才有意义。②组织中发现分隔分枝的菌丝多为曲霉；粗大、不分隔或不分枝的菌丝多为毛霉；假丝酵母菌出现假菌丝代表活动性，有意义。③皮肤癣菌菌丝肥大粗长，提示处于活跃状态。④酵母型和二相型真菌在组织内常呈现为孢子。

（一）不染色标本直接检查法

用小镊子取甲屑或皮屑少许或病发一根，置于载玻片中央，滴加10%KOH溶液1滴～2滴。稍待片刻，盖上盖玻片，将载玻片放在火焰上方微加热。使组织或角质溶解，但切勿过热以免产生气泡或烤干。冷后，压紧盖玻片使溶解的组织分散并使其透明，驱逐气泡并吸去周围溢液，避免沾污盖玻片。先用低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查菌丝、孢子的特征。镜检时用稍弱的光线使视野稍暗为宜。低倍镜下，菌丝呈折光性较强、绿色纤维分枝丝状体；高倍镜下，菌丝分隔,有时菌丝末端有较粗短关节孢子。镜检时若见菌丝或孢子，即可初步诊断患有真菌癣，但一般不能确定其菌种。

（二）乳酚棉蓝（lactophenolcottonblue）染色法（第三章染色技术）

（三）墨汁涂片法（第三章染色技术）

二、培养

直接镜检不能确诊时应作真菌培养。皮肤、毛发、甲屑标本经70%乙醇或2%石炭酸浸泡2min～3min杀死杂菌，无菌盐水洗净后接种于含放线菌酮和氯霉素的沙保（Sabouraud）培养基（将葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，琼脂20.0g溶解于1000ml蒸馏水中，经68.95kPa高压蒸汽灭菌15min即可。）上，25℃～28℃培养数日至数周，观察菌落特征。必要时做小培养，即切取一小块沙保培养基置玻片上，挑取小片真菌菌落接种在培养基周边，盖上无菌盖玻片，培养一周后用乳酚棉蓝染色，于镜下观察菌丝、孢子特征进行鉴定。阴道、口腔粘膜材料可用棉拭子直接在血平板上分离。血液需先增菌。脑脊液则取沉淀物接种于血平板上37℃培养。若疑为假丝酵母菌取菌落接种于0.5ml血清试管内，37℃1h后涂片革兰染色。见有假丝酵母菌细胞长出芽管即可初步鉴定为白假丝酵母菌。

三、鉴定试验

（一）芽管形成试验

取无菌小试管一支，加入0.2ml动物或人血清,接种少量真菌，充分振荡混合数分钟后，置37℃恒温箱中培养，每隔1h用接种环取出1环含菌血清，置于载玻片上加上盖玻片镜检，共检查3次。白色假丝酵母菌可由孢子长出短小的芽管。

（二）厚膜孢子形成试验

按时钟文字顺序将玉米粉Tween80平板（将玉米粉10.0g混于1000ml蒸馏水中，加热65℃lh,过滤，补足到原水量，再加入琼脂10.0g及10mlTween80，灭菌后分装平皿内）分成12个部分。先从10点处向2点处方向用接种钩在培养基深层划线培养（不超过深度2/3），然后在4点及8点两处进行点种。

（2）分别在划线处的中央和点种处盖上无菌盖玻片。轻轻按压后置22℃～25℃环境培养，经18h～24h培养后观察结果。白色假丝酵母菌可形成厚膜孢子。

（李国才、焦红梅、陈群、陈红菊、严华、杨维平）